背景
BACKGROUND
脑脊液(CSF)产生和清除（流入/流出）之间的平衡对于大脑发育和功能行使至关重要。在一些先天性脑积水、精神分裂等神经发育相关疾病患者中，早在婴儿时期已经出现脑脊液积聚的异常表型。通常CSF的吸收清除主要通过蛛网膜粒，脑膜淋巴管也参与了该过程。然而，在婴儿时期蛛网膜粒和淋巴管系统均未完全形成。因此，围产儿大脑中脑脊液如何进行清除这一过程仍然未知。
脉络丛（ChP）是在脑室中由软脑膜及其上的反复分支的血管和室管膜上皮共同构成的脉络状组织丛状结构。作为血脑屏障的重要组成，脉络丛在胚胎期已经形成，其表面存在多种离子转运体和液体转运通道，是产生脑脊液的主要结构。既往临床和基础研究表明ChP还存在吸收功能。因此在本研究中，作者以小鼠为研究模型进一步探索发育早期ChP在脑脊液清除吸收过程中的作用以及潜在机制。
结果
RESULTS
发育早期脑脊液中K+浓度急剧下降
研究者在小鼠发育不同时间点通过电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES）和离子色谱（IC）测量了CSF中关键几类离子浓度水平，包括Na+、K+和Cl-。结果显示CSF[K+]在出生时最高（9.6±3.5mM），P7迅速降至4.4±0.9mM，并逐渐回落至成人水平（3.1±0.6mM）（图1a）。CSF[Na+]和[Cl-]则变化较小。需要注意的是，脑脊液与血清中[K+]比率在P0-P7期间也出现急剧下降（图1b）。在以往基于成年动物的研究中表明，当CSF[K+]高于稳态水平时，机体会迅速对CSF中K+进行清除。那么这提示着，机体在P0-P7时期CSF已经开始出现清除现象。而K+转运蛋白往往与水转运协同进行。由此推测CSF[K+]的变化可能也驱动了大脑中脑脊液的流出。为了进一步解发育早期大脑CSF吸收作用机制，作者探索了CSF中K+的清除作用特性。
研究者发现CSF中K+快速清除时期浓度变化曲线与脉络丛代谢变化趋势相似（图1a,b,h,i），提示ChP可能通过表面上皮细胞的K+协同转运蛋白（主动转运，需要能量）推动了K+的快速清除。通过测量氧耗量也发现，P0-P7ChP上皮细胞代谢活性最高（图1i,j），且线粒体定位也更靠近ChP顶端表面。根据以上实验结果，研究者推测ChP上皮细胞通过ATP依赖性机制促进CSF中K+清除。
▲图1
NKCC1是介导CSF清除的潜在机制
为确定ChP上哪些转运体参与了CSF清除吸收作用，研究者对E16.5和成年ChP通过翻译核糖体亲和纯化的方法（Trap）进行核糖体图谱分析。富集分析结果表明，相较于胚胎期，成年ChP中主动跨膜转运和线粒体相关基因转录更活跃，尤其是离子通道转运相关功能（图2c,d），提示ChP在出生后获得CSF液体和离子浓度调节功能，而该功能实现依赖于离子转运体。
根据测序数据结果分析，研究者认为NKCC1（Slc12a2）是最有可能介导CSF清除的转运蛋白。NKCC1作为钠钾氯共转运蛋白，除了清除CSF中K+，还可以进行H2O协同转运，NKCC1的活性也受到磷酸化额外调控。与其他Na+/K+ATP酶和相关调控因子相比（ATPA1、ATPBA、Klotho），NKCC1在ChP上皮组织中含量尤其丰富（图2f-j)。
此外，研究者还发现P0-P7幼崽大脑ChP上皮细胞中磷酸化的NKCC1水平升高，P7后表达量则逐渐下降，表明在出生后第一周内NKCC1活性增加(图2d)，这与图1中CSF[K+]下降以及ChP中ATP生产时间点是一致的。综上，研究者确认ChP中NKCC1转运体是出生后CSFK+和液体清除的潜在介导机制。
▲图2
NuRD复合体参与NKCC1表达调控
研究者以往的测序数据表明，与表观调控相关的NuRD复合体中CHD家族蛋白、HDAC1/2和MBD3均在脉络丛中表达，尤其Chd4存在高表达（图3a）。临床证据表明，一些先天性脑积水和脑室扩大症状的患儿伴有CHD4基因突变，说明Chd4可能参与了CSF清除过程。本研究中，定位于ChP上皮细胞核中的CHD4在出生后才被检测到（图3b），而胚胎期并不表达。免疫沉淀也确认了出生后ChP中NuRD复合体成分表达情况（图3c）。接下来，研究者在胚胎期通过AAV条件性敲除Chd4基因，随之观察到，出生后大脑ChPNKCC1表达显著低于正常水平（图3f）。以上结果表明，NuRD/ChD4复合物是调控发育时期脉络丛中NKCC1表达的重要因素。
▲图3
ChP上NKCC1介导CSF进行液体清除
为了探究NKCC1是否在CSF[K+]快速下降的窗口期（P0-P7）将CSF转运至ChP中，研究者在胚胎期诱导ChP上皮细胞中NKCC1过表达（OE）（图4a-i），检测了P1时期ChPNKCC1OE组和对照小鼠CSF[K+]。结果发现ChPNKCC1OE组比对照组CSF[K+]下降程度更大，其数值接近于对照组P7（图4j），表明在促进ChPNKCC1表达后，CSF中K+清除加速。即出生早期CSF[K+]高浓度的急速下降依赖于ChPNKCC1转运蛋白将K+从CSF中转出。
▲图4
接下来，研究者发现ChPNKCC1OE小鼠的侧脑室变小，并通过T2加权MRI实时成像检测进一步明确了该现象。结果显示P14时期，NKCC1OE组小鼠的侧脑室容积减少（图5a-b），但整体大脑大小没有改变（图5c)，反映存在循环脑脊液减少。且该现象差异在P50检测时仍旧存在，提示ChPNKCC1参与了出生后早期CSF脑脊液液体清除吸收，若该过程被影响（例如促进），CSF循环稳态会持续受损。
接下来，研究者探究了当ChPNKCC1OE增强脑脊液清除后，大脑颅内顺应性(Ci)和CSF流出阻力(RCSF)是否受到影响。通过恒速输注人工脑脊液aCSF人为增加脑室内CSF体积，诱导ICP上升并稳定在一个新的水平（图5d-e），过程中实时监测颅内压。结果发现ChPNKCC1OE组小鼠在5-7周龄时Ci显著增加（图5f,g)，这与前期脑脊液清除过多结果一致。
▲图5
NKCC1过表达减轻阻塞性脑积水症状
在本研究已有结果表明ChPNKCC1OE促进脑脊液清除吸收。因此研究者假设ChPNKCC1OE可减轻出生后梗阻性脑积水模型中的脑室扩大症状。研究者在胚胎期过表达ChPNKCC1，在P4时进行单侧侧脑室阻塞性脑积水造模，最终在P14时通过实时MRI评估侧脑室容积（图6a）。虽然NKCC1OE组和对照组小鼠在P14时脑室均出现扩大，但与对照相比，NKCC1OE小鼠的脑室扩大减少，平均脑室容积小于对照的1/3（图6b-d）。因此，过表达ChPNKCC1是脑积水的潜在治疗方案。
▲图6
总结
CONCLUSION
本文研究结果表明，脑室脉络丛在发育早期调控脑脊液体积和离子组成，可能参与指导了早期大脑发育。此外，针对该种吸收途径有望改善先天性脑积水和其他脑部发育疾病的CSF液体异常聚集。
原始文献：
XUH,FAMERM,SADEGHC,etal.ChoroidplexusNKCC1mediatescerebrospinalfluidclearanceduringmouseearlypostnataldevelopment[J].NatCommun,,12(1):.
编译：蒋明
排版：蒋明
校审：方芳
缪长虹
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